l 1x RIPA 緩沖液：50 mM Tris、 150 mM NaCl 、0.1% SDS、0.5% 脫氧膽酸鈉、 1% Triton X-100 或 NP40。

l 1x PBS 緩沖液：137 mM NaCl、2.7 mM KCl 、2.7 mM Na 2 HPO 4、2.7 mM KH 2 PO 4、 pH 7.4

l BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒或 Bradford 蛋白檢測(cè)試劑盒

l 1.5 M Tris 緩沖液 (pH 8.8)： 90.68 g Tris-HCl 至 ddH 2 O，使用 HCl 將 pH 調(diào)節(jié)至 8.8，最后 500 ml

l 1.0 M Tris 緩沖液 (pH 6.8)：60.58 g Tris-HCl 至 ddH 2 O，使用 HCl 將 pH 調(diào)節(jié)至 6.8，最后 500 ml

l 10% APS：使用前制備的 1 ml ddH 2 O中的 100 mg AP 。

l 10% SDS：10 g SDS 在 100 ml ddH 2 O 中。

l 1x Tris-甘氨酸緩沖液：Tris配比25 mM；  PH=8.3 的甘氨酸配比230 mM、 SDS配比0.1% 。

l 3x SDS 蛋白上樣緩沖液配制：使用PH=6.8 的 Tris 150 mM 、SDS添加6% 、甘油 添加30% 、 EDTA濃度30 mM 和 溴酚藍(lán) 配比0.2% 。緩沖液應(yīng)隨用隨配、分裝冷凍備用。1x TTBS ： 25 mM Tris（pH 7.5）：0.15 M NaCl 、 0.05% Tween-20、0.001% 硫柳汞

l 1x 轉(zhuǎn)移緩沖液：3 g Tris、14.4 g 甘氨酸和 200 ml 甲醇，添加 ddH 2 O 至 1L

l 去除上清液并用 1X PBS 洗滌以去除殘留培養(yǎng)基。

l 添加預(yù)冷的 400 ul-1 ml 1X RIPA 緩沖液/100 mm 培養(yǎng)皿。在冰上孵育 5-10 分鐘。

l 刮去細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到冰上預(yù)冷的 1.5 ml 微管中。

l （可選）均質(zhì)化或超聲處理。

l 4°C 12,000 rpm 離心 10-15 分鐘，收集上清液備用。

l 總蛋白應(yīng)儲(chǔ)存在 -20°C 直至需要。 

l （可選）取出 100 ul 等分試樣進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

l 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的 1.5 ml 微管或 15 ml 試管中，并在 4°C 下以 2000 rpm 的速度離心 5 分鐘。

l 取出培養(yǎng)基，用 1 ml 預(yù)冷的 1x PBS 重懸沉淀，然后轉(zhuǎn)移到 1.5 ml 微管中。

l 在 4°C 下以 2000 rpm 離心 5 分鐘。

l 用 1 ml 預(yù)冷 RIPA 緩沖液/10 7 個(gè)細(xì)胞重懸細(xì)胞沉淀

l 將細(xì)胞懸液在冰上搖晃 30 分鐘。或均質(zhì)化/超聲處理。

l 4°C 12000 rpm 離心 10-15 分鐘，收集上清液備用。

l 總蛋白應(yīng)儲(chǔ)存在 -20°C 直至需要。

l 組織制備和定量。把它們切成小塊。

l 添加約 500-600 ul 預(yù)冷的 1x RIPA 緩沖液/100 mg 組織。

l 均勻組織。

l 在 4°C 下以 12000 rpm 離心 15-20 分鐘。

l 收集上清液備用。

l 總蛋白應(yīng)儲(chǔ)存在 -20°C 直至需要。

l 在 1X 轉(zhuǎn)印緩沖液中預(yù)潤(rùn)濕凝膠、Whatman 紙和海綿等材料。

l PVDF 膜應(yīng)在甲醇中孵育 10 秒。至 1 分鐘，然后移至 1X 轉(zhuǎn)移緩沖液。

l 將以下材料堆疊：外殼（黑色面）、海綿、Whatman 紙、凝膠、膜、Whatman 紙、海綿、外殼（透明面）。

l 將黑色面朝黑色放入轉(zhuǎn)印設(shè)備中。

l 在低溫環(huán)境中，使用轉(zhuǎn)印緩沖液進(jìn)行轉(zhuǎn)印操作。轉(zhuǎn)印電流和時(shí)間可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程和使用說(shuō)明進(jìn)行優(yōu)化。

l 一抗在 1X TBST+3% BSA 中以推薦的稀釋度稀釋或根據(jù)結(jié)果優(yōu)化稀釋度。

l 在 4°C 下孵育過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間，或在室溫下孵育 4 小時(shí)。

l 回收一抗并儲(chǔ)存在 4°C。然后在 RT 的振動(dòng)篩上洗滌膜 3X 5-10 分鐘。

l 在 1X TBST 中稀釋二抗并將膜在室溫下孵育 1 小時(shí)或在振蕩器上在 4°C 下孵育 2-4 小時(shí)。

l 在 RT 的搖床上用 TBST 洗滌 3X 10 分鐘。