實時熒光pcr檢測利用熒光分析法用特定結合DNA的染料來測定DNA的濃度。常用的DNA染料包括 溴化乙錠、Hoechst33258、SYBR Green I 和 II、SYBR Gold 及 PicoGreen。

 溴化乙錠
溴化乙錠含有三環(huán)菲嚏平面環(huán)系統(tǒng)，可嵌入到雙鏈DNA堿基之間。嵌入DNA雙螺旋 后，溴化乙錠的菲嚏環(huán)平面位于與螺旋軸相垂直的位置，并通過范德瓦耳斯力與上下堿基 結合。而其平面環(huán)系統(tǒng)被埋在底部，其外側的苯基和乙烷基處于DNA雙螺旋的大溝內。 在高強度離子溶液的飽和狀態(tài)，大約每2.5個堿基對嵌入一分子的溴化乙錠，這與DNA的 堿基組成無關。溴化乙錠的嵌入一般不會對堿基對的構象及其在螺旋中的位置產生影響， 除了會使堿基對沿螺旋軸移位3.4A (Waring 1965)。這種移位可造成飽和溴化乙錠的DNA 分子長度增加 27% 。
溴化乙錠還可以高度可變計量學與RNA和熱變性或單鏈DNA形成的鏈間堿基對結合 (Waring 1965, 1966； Lepecq and Paoletti 1967)?溴化乙錠平面基團的固定位置及其與堿 基的密切接近可使結合的染料散發(fā)的熒光比游離在溶液中的染料要強20-25倍O 254nm的 紫外線(UV)照射由DNA吸收，并轉移至溴化乙錠；302nm和366nm的紫外線照射由溴 化乙錠本身吸收。在590nm和可見光的紅-黃區(qū)一小部分(約0.3)可被重新釋放出來(Lepecq and Paoletti 1967 ； Tuma et al. 1999)?
大多數(shù)銷售的UV光源可發(fā)射302nm的UV光。溴化乙錠-DNA復合物在此波長產生 的熒光明顯強于366nm，但略微低于較短的波長(254nm)。然而，DNA分子的光漂白和 斷裂作用在302nm要比在254nm處低得多。
溴化乙錠主要用于檢測瓊脂糖中的DNA,但 這種染料也還可以用于半定量地估算DNA溶液的濃度。
▲在酵母及沙門氏菌中，溴化乙錠本身并不容易誘發(fā)突變，但它通過微粒體酶代謝的化合物可中度誘變，多數(shù)研究所開發(fā)了安全操作及處理含有 溴化乙錠溶液及膠的說明。研究者應該根據(jù)這些說明來處理溴化乙錠。安全處理溴化乙錠的試劑盒也可通過Schleicher & Schuell和Qbiogene 公司及其他渠道獲得。
Hoechst 33258
Hoechst 33258是一類雙-苯并咪哩熒光染料，可高特異性非插入地結合于DNA雙鏈的 小溝。結合的染料產生的熒光從0.01 ±升到0.6 ,因此，Hoechst 33258用于雙鏈DNA溶液的熒光檢測及定量。Hoechst 33258比溴化乙錠更優(yōu)先使用，因 為它具有非常強的區(qū)分雙鏈DNA與RNA及單鏈DNA的能力。
與其他非嵌入染料類似, Hoechst 33258可優(yōu)先結合DNA螺 旋中的富含A/TK(Weisblum and Haenssler 1974),并隨著A+T含量的增加，熒光強度以 10的對數(shù)增長= Hoechst 33258與雙鏈DNA結合產生的熒光比與單 鏈DNA結合要強3倍左右。
SYBR Green I
SYBR Green I (Life Technologies)是一種嵌入型青藍色染料，在488nm藍色光照射激 發(fā)后，在522nm (綠光)具有發(fā)射高峰。盡管SYBR Green I可加入到凝膠上樣緩沖液中， 但并不推薦這樣使用，因為該染料對DNA在凝膠中的遷移影響很大。為得到好的效果， 凝膠應該進行預染處理。由于產生的熒光很強，SYBR Green I是一種可用于檢測少量DNA
(低拷貝/PCR產物數(shù)量少)的理想染料。少至20pg的DNA或250pg多分散性DNA在經 過SYBR Green I染色后，凝膠可用基于CCD的圖像記錄系統(tǒng)進行檢測。
因為SYBR染料-DNA復合物在非極性溶液中可解離，因此可用乙醇沉淀的方法將 SYBR Green I 從 DNA 中去除。
SYBR Green II
SYBR Green II (Life Technologies)主要用于對電泳后的RNA和單鏈DNA進行染色。 由于該染料在結合RNA后發(fā)出非常亮的熒光及其在凝膠中的低背景，SYBR Green II經常 用來對多聚甲醛/瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠中的RNA進行染色。
利用肝臟提取物進行Ames實驗顯示SYBR染料與溴化乙錠相比致癌性要低(Singer et aL 1999)。但SYBR Green在暴露于UV的細菌中比溴化乙錠更容易誘發(fā)突變(Ohta et al. 2001 )o Life Technologies公司現(xiàn)在銷售更安全的SYBR染料(SYBR-Safe DNA凝膠染色) (見 Martineau et al. 2008)。
SYBR Gold
SYBR Gold (Life Technologies)是檢測凝膠中DNA和RNA高度靈敏的染料，與300nm 紫外光源和基于CCD的圖像記錄系統(tǒng)聯(lián)合使用。結合DNA后，SYBR Gold在495nm和 300nm處均有大激發(fā)(發(fā)射波長可達537nm)。
結合核酸后，SYBR Gold的熒光增強程度是溴化乙錠的30多倍。SYBR Gold染凝膠 中DNA的靈敏度是SYBR Green I的10多倍，染乙醛酸化的RNA的靈敏度是溴化乙錠的 25倍以上。
SYBR Glod也可用于檢測甲基敏感的單鏈構象分析(MS-SSCA) (McKee and Thomson 2004)0然而，由于其成本較高，SYBR Gold并不是檢測凝膠中DNA或DNA定量的常規(guī) 選擇染料。Ames實驗顯示SYBR Gold并不具有誘變作用(Kirsanov et al. 2010),并且不像 其他菲嚏類染料如溴化乙錠，SYBR Gold可很容易地通過乙醇沉淀法從DNA中去除。
PicoGreen
PicoGreen (Life Technologies)是一種耐光性染料，在480nm處有*大激發(fā)，在520nm 處有發(fā)射高峰，可特異結合雙鏈DNA。在檢測溶液中雙鏈DNA時，其具有高靈敏度和 大動力性范圍。PicoGreen廣泛應用于多孔板DNA樣品的自動化檢測和定量。利用一個 染料濃度，可檢測1?1000ng/mL的DNA樣品，并可通過手持型熒光分析儀進行精確定量 。
將染料從DNA中去除
在推薦使用濃度范圍內，SYBRGreen I和SYBR Gold并不顯著抑制限制酶、連接酶及 熱穩(wěn)定DNA聚合酶的活性。這些染料不像溴化乙錠和其他菲嚏類染料，可非常容易通過 乙醇沉淀法從DNA中去除。
  溴化乙錠染DNA后可抑制后續(xù)酶促反應中DNA作為模板或底物的能力。幸運的是， 溴化乙錠可通過兩次等體積的異丙醇或酚：氯仿(25 : 1)萃取，非常容易并快速地從DNA 中去除。去染色的DNA可再通過乙醇沉淀回收。
   實際上，所有用于純化DNA的商業(yè)試劑盒或系統(tǒng)都可有效地將溴化乙錠及其他DNA 結合染料從DNA中去除。

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