類器官是復(fù)雜的 3-D 器官樣微組織，由多種分化的細(xì)胞類型組成，其結(jié)構(gòu)組織類似于體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞，具有中央腔和其他類似體內(nèi)的結(jié)構(gòu)特征。從ipsc誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 產(chǎn)生的類器官已被描述用于胃、腸、肺、大腦、腎、肝臟等各種組織，這些類器官是其他體外模型的有吸引力的替代品；這些微組織比 2-D 細(xì)胞培養(yǎng)或簡單的 3-D 球體聚集體更好地概括了體內(nèi)組織表型，但沒有與器官外植體或組織切片相關(guān)的挑戰(zhàn)，例如培養(yǎng)壽命有限。事實(shí)上，類器官保留了許多細(xì)胞培養(yǎng)的典型有利特征，例如維持穩(wěn)定培養(yǎng)數(shù)月的能力，以及冷凍保存和恢復(fù)培養(yǎng)物的能力。類器官也適用于許多標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，包括使用 CRISPR/Cas9 進(jìn)行基因修飾、免疫熒光染色、RNA 表達(dá)定量、蛋白質(zhì)印跡和毒性測定。類器官培養(yǎng)物已被用于基礎(chǔ)研究和轉(zhuǎn)化研究。例如，腸道類器官已被證明可在體內(nèi)植入，用作囊性纖維化模型使用來源的肺 iPSC，并探索宿主與細(xì)菌與沙門氏菌的相互作用。 腎臟類器官已用于研究腎毒性，胃類器官被證明是幽門螺桿菌感染的合適模型。在這里，我們簡要介紹了一種，用于在特定培養(yǎng)基中結(jié)合使用 2-D 和 3-D 培養(yǎng)的方式從三個 人類 iPSC 細(xì)胞系（ 生成胃腸道 (GI) 類器官。
ipsc誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 誘導(dǎo)分化培養(yǎng)
簡而言之，使用多能干細(xì)胞培養(yǎng)基在無飼養(yǎng)層和無血清條件下將iPSC 維持在  細(xì)胞基底膜包被的培養(yǎng)皿上。每天更換培養(yǎng)基。在常規(guī) iPSC 培養(yǎng)過程中，細(xì)胞每 3-5 天使用干細(xì)胞解離試劑傳代一次，并作為小聚集體接種。對于類器官的生成，使用了未顯示自發(fā)分化跡象的低傳代 iPSC。


iPSC 誘導(dǎo)分化步驟：
一、定形內(nèi)胚層分化
根據(jù)說明書重構(gòu)所有利基因子，并在 -80°C 下作為一次性等分試樣儲存。iPSC 被接種到 Cell Basement 包被的 24 孔多孔板中，并生長至 30-50% 的匯合度。B27 補(bǔ)充劑 和 100 ng/mL 激活素 A 組成的定形內(nèi)胚層 (DE) 分化培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基三天。第一天，DE 培養(yǎng)基還含有 2 µM CHIR99021。培養(yǎng)基是新鮮的并且每天更換三天。
二、后腸球體生成
在 DE 誘導(dǎo)后，通過在 RPMI-1640、B27、100 ng/mL 激活素 A、3 µM CHIR99021 和 500 ng/mL 成纖維細(xì)胞生長因子 4（FGF4）中培養(yǎng)四天，生成中/后腸球體。媒體是新鮮的，每天都在變化。
三、后前腸球體生成
在 DE 誘導(dǎo)后，通過在 RPMI-1640、B27、2 µM CHIR99021、500 ng/mL FGF4 和 200 ng/mL noggin 中培養(yǎng)三天，生成后前腸球體。第一天，培養(yǎng)基還含有 2 µM 視黃酸 。每天更換媒體。媒體每天都是新鮮的。
四、腸道類器官生成
收集中/后腸球體并重新懸浮在冰冷、未稀釋的細(xì)胞基底中。大約 10-20 個球體被鍍在 24 孔板的每個孔中，每滴 50 μL。鋪板后，將板在 37°C 下保持 15 分鐘以使凝膠聚合，在孔中心形成 3-D 圓頂。凝固的凝膠覆蓋有預(yù)熱的完整腸道類器官培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由 Advanced DMEM:F12、N2 補(bǔ)充劑 、B27 補(bǔ)充劑、L-谷氨酰胺、10 mM HEPES 、100 ng/mL 表皮生長因子（EGF）、100 ng/mL noggin和 500 ng/mL R-spondin-1。每 3-4 天更換一次培養(yǎng)基，每 7-14 天通過機(jī)械解離將類器官傳代到新鮮的細(xì)胞基底中。完整培養(yǎng)基在 4°C 下儲存不超過三天。
五、胃類器官生成
收集后部前腸球體并重新懸浮在未稀釋的細(xì)胞基底中。大約 10-20 個球體被鍍在 24 孔板的每個孔中，每滴 50 μL。接種后，將板在 37°C 下保持 15 分鐘以聚合凝膠，在孔中心形成 3-D 圓頂。凝固的凝膠覆蓋有預(yù)熱的完整胃類器官培養(yǎng)基，包括高級 DMEM：F12、N2 補(bǔ)充劑、B27 補(bǔ)充劑、L-谷氨酰胺、10 mM HEPES、100 ng/mL EGF、200 ng/mL noggin 和 2 µM 視黃酸酸。每 3-4 天更換一次培養(yǎng)基，每 7-10 天將類器官嵌入新鮮的細(xì)胞基底中。完整培養(yǎng)基在 4°C 下儲存不超過三天。
六、免疫熒光和免疫組織化學(xué)
細(xì)胞單層、球體或組織在 PBS磷酸鹽緩沖液中洗滌兩次， 并在室溫下固定在 4% 多聚甲醛中 15 至 30 分鐘。固定的球體/類器官被包埋在石蠟中，以 5-10 µm 切片，并安裝在幻燈片上用于后續(xù)染色。對于免疫熒光染色，細(xì)胞單層或組織切片在含有 5% 驢血清、0.5% Triton-X、0.2% Tween-20 和 1% 牛血清白蛋白的 PBS 中在室溫下封閉和透化 1 小時。一抗在封閉緩沖液中稀釋，并在 4°C 下與細(xì)胞一起孵育過夜。熒光二抗在封閉緩沖液中稀釋，并與細(xì)胞在室溫下避光孵育 1 小時。使用蘇木精、曙紅和 PAS-Alcian Blue 進(jìn)行組織學(xué)染色。 
總結(jié)
 在體內(nèi)，DE 產(chǎn)生消化道，是 GI 類器官發(fā)育過程中關(guān)鍵的第一步。免疫染色顯示，在 DE 分化培養(yǎng)基中三天后，特征性 DE 標(biāo)記物 FOXA2 和 SOX17 的表達(dá)超過 80%，并且中胚層標(biāo)記物 brachyury（數(shù)據(jù)未顯示）的表達(dá)較小。

   在前腸或后腸分化培養(yǎng)基中 3 至 4 天后，形成漂浮或半粘附的球體以及粘附的細(xì)長管狀結(jié)構(gòu)。后腸分化培養(yǎng)基產(chǎn)生的球體對腸道標(biāo)記物 CDX2 呈陽性，但對后腸標(biāo)記物 SOX2 呈陰性，而前腸分化培養(yǎng)基產(chǎn)生的球體為 CDX2-/SOX2+。
在球體嵌入 ATCC 細(xì)胞基底膜并保存在類器官生成培養(yǎng)基中后的 7 天內(nèi)，大的簡單圓形類器官變得可見，直徑約為 100-200 µm。到第 30 天時，類器官的大小和復(fù)雜性大大增加，直徑為 1500-2000 µm，并且有許多可見的管狀和隱窩/芽狀結(jié)構(gòu)。
    30 天以上類器官的免疫染色顯示復(fù)雜的折疊結(jié)構(gòu)、柱狀上皮、隱窩樣結(jié)構(gòu)和許多胃腸道標(biāo)志物的表達(dá)，包括前腸標(biāo)志物 PDX1、后腸標(biāo)志物 CDX1、MUC1 和 MUC5AC 陽性粘蛋白分泌細(xì)胞、溶菌酶 (LYSO) - 陽性潘氏細(xì)胞和絨毛蛋白 (VILL) 陽性腸細(xì)胞。類器官周圍的細(xì)胞包含異質(zhì)細(xì)胞群，這些細(xì)胞表達(dá)波形蛋白 (VIM)、纖連蛋白和平滑肌α肌動蛋白 (α-SMA)。粘蛋白表達(dá)僅限于杯狀細(xì)胞和類器官的中央腔，其中還含有死細(xì)胞和碎片. 用 H&E 和 PAS-Alcian Blue 進(jìn)行的組織學(xué)染色顯示存在酸性和中性粘蛋白，以及成熟類器官內(nèi)的組織樣形態(tài)。

與簡單的 3-D 球體或傳統(tǒng)的 2-D 培養(yǎng)模型相比，類器官可以更忠實(shí)地再現(xiàn)復(fù)雜的生理結(jié)構(gòu)。然而，類器官并非沒有局限性。雖然 iPSC 衍生的 GI 類器官表現(xiàn)出體內(nèi)組織的許多特征，但它們不能捕捉成熟組織的表型。例如，它們?nèi)狈w內(nèi)組織的許多方面，例如脈管系統(tǒng)以及與神經(jīng)和免疫系統(tǒng)的相互作用。此外，雖然類器官在體內(nèi)顯示出類似細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)，但它與原代胃腸道組織中的組織結(jié)構(gòu)并不一致，而且任何單個類器官的大小、復(fù)雜性、活力和特定細(xì)胞類型的表達(dá)都可能存在顯著差異。雖然用于生成類器官的分化培養(yǎng)基可能是定義的，但大多數(shù)類器依賴于未定義的、小鼠來源的細(xì)胞外基質(zhì)，這限制了它們的臨床應(yīng)用。盡管存在這些挑戰(zhàn)，類器官培養(yǎng)方法仍然是一種有用的工具，可以增加我們對器官發(fā)育的理解，并為藥物篩選或再生醫(yī)學(xué)等個性化醫(yī)學(xué)方法帶來希望。
類器官的產(chǎn)生嚴(yán)重依賴于各種利基因素的貢獻(xiàn)和特定組織適當(dāng)信號通路的暫時受限激活。我們發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)中中使用的許多重組蛋白和小分子的活性存在顯著的批次間和供應(yīng)商間差異。類器官的生成依賴于一系列特定的發(fā)育事件，這些事件嚴(yán)重依賴于先前的階段。特別是，如果iPSC 的 DE 形成的初始步驟不是 80-90%，我們發(fā)現(xiàn)類器官生成通常不成功。另外，一些分化標(biāo)記在類器官達(dá)到一定的成熟階段之前并不明顯；我們建議將 GI 類器官培養(yǎng)至少 30 天，在某些情況下，可能需要 60 天以上才能出現(xiàn)完整的細(xì)胞類型。
     
     蘇州阿爾法生物提供的ipsc誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、誘導(dǎo)分化干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、干細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基等廣泛應(yīng)用于類器官生成，組織形成等領(lǐng)域。更多細(xì)胞生物學(xué)、干細(xì)胞相關(guān)內(nèi)容 進(jìn)入網(wǎng)站了解。